每個(gè)細(xì)胞都是一座城，城中則擠滿了核酸分子和蛋白質(zhì)等原住居民。血液作為繞城而行護(hù)城河滋養(yǎng)著每座城的同時(shí)也積淀著大量的寶藏。小個(gè)子外泌體（30-100nm）、大塊頭微囊泡（1000nm）及細(xì)胞分泌物（核酸分子）等外來(lái)移民們不停地穿梭于護(hù)城河之中，并形成一股無(wú)形的紐帶連接著每座城。
即是移民，其身上總會(huì)烙印著家鄉(xiāng)（原活細(xì)胞）的印跡。比如偏愛(ài)護(hù)犢子的外泌體（exosome），它就將自家娃（蛋白質(zhì)、RNA、DNA片段）保護(hù)的極好，隨便單拎一個(gè)娃出來(lái)都成為故鄉(xiāng)的最佳代表，而這完全歸功于它對(duì)核酸酶、蛋白酶等危險(xiǎn)因子不余遺力地掃地出門。它的這種拼盡全力的姿勢(shì)，落在腫瘤細(xì)胞的眼里后深得其歡心，雖然它長(zhǎng)時(shí)間不被人們所重視，卻早已被腫瘤納為在機(jī)體中轉(zhuǎn)移探路的先鋒部隊(duì)。
好在亡羊補(bǔ)牢為時(shí)不晚，現(xiàn)階段不少研究者正于護(hù)城河中挖寶追蹤，并期冀擼清楚外來(lái)移民與腫瘤之間千絲萬(wàn)縷的關(guān)系，進(jìn)而可以早期診斷或監(jiān)測(cè)疾病。無(wú)奈，對(duì)外來(lái)移民的安檢（檢測(cè)）方法一直都處于探索階段，很難統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化。因而TheScientist雜志的多位牛人分享了自家隔離外來(lái)移民的戰(zhàn)略方針，并貢獻(xiàn)出了相應(yīng)的注意事項(xiàng)和實(shí)驗(yàn)技巧。
DNA甲基化圖譜分析
研究者：香港中文大學(xué)的盧煜明（DennisYuk-mingLo）教授，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷的奠基人，一生致力于人體內(nèi)血液的DNA研究，并率先提出了在孕婦血液中檢測(cè)胎兒DNA的理論。
研究項(xiàng)目：常言道，愛(ài)美之心人皆有之。DNA也不例外，它在表觀遺傳學(xué)的“裝飾包裝”之下變得煥然一新，并深刻影響著細(xì)胞對(duì)基因表達(dá)的控制。因而，盧教授則千里追蹤血源性DNA的甲基化圖譜以檢測(cè)異常循環(huán)DNA的器官來(lái)源。
研究成果：盧教授的研究團(tuán)隊(duì)利用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序法研究了血漿DNA的甲基化模式，并從十四種不同組織（包括肝臟，血細(xì)胞，胎盤等等）的甲基化組中挖掘出5,820個(gè)帶有足夠組織信息的甲基化生物標(biāo)記。隨后他們利用生物信息學(xué)重迭解析處理（bioinformaticsdeconvolutionprocess）方法，以辨別血漿DNA的組成百分比或組織圖。而這幅血漿DNA甲基化模式的“鳥(niǎo)瞰圖”可指出異常循環(huán)DNA的組織器官起源。
注意事項(xiàng)：血液中甲基化組會(huì)存在個(gè)體間的差異變化。另外，測(cè)序時(shí)重亞硫酸鹽會(huì)破壞一些DNA而產(chǎn)生偏好性，因而，單分子測(cè)序等更靈敏的方法可有利于血液甲基化研究。
前景展望：盧教授認(rèn)為分析血液中的組織特異性甲基化模式還會(huì)有更多的用途，比如追蹤移植排斥或者鑒定循環(huán)腫瘤DNA的來(lái)源。其發(fā)表于PNAS雜志的一項(xiàng)研究則通過(guò)分析血液中的甲基化DNA，檢測(cè)到了癌癥患者的肝腫瘤和淋巴瘤，以及孕婦胎盤中的遺傳異常；并為分子診斷與基于器官的傳統(tǒng)醫(yī)療之間搭起了一道橋梁。
外泌體蛋白檢測(cè)
研究者：加州大學(xué)醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)教授EdwardGoetzl
研究項(xiàng)目：都說(shuō)“死別”是人生苦，可“生離”又何嘗不讓人肝腸寸斷！阿茨海默癥（AD）無(wú)情的侵蝕著摯愛(ài)親人的生命色彩，并讓他們遺忘了這個(gè)世界。因而，EdwardGoetzl教授則期望通過(guò)追蹤AD患者外泌體的β淀粉樣蛋白和tau蛋白，來(lái)實(shí)現(xiàn)定期血檢來(lái)監(jiān)控AD患者的疾病歷程。
研究成果：Goetzl的研究團(tuán)隊(duì)收集了AD患者確診前后的血樣，并通過(guò)SystemBiosciences公司的ExoQuick分離血樣中的所有外泌體，再用結(jié)合神經(jīng)元表面蛋白的抗體富集神經(jīng)元外泌體，檢測(cè)這些外泌體所含的蛋白質(zhì)。研究顯示，在阿爾茨海默癥患者的神經(jīng)元外泌體中，tau、磷酸化tau和β淀粉樣蛋白的表達(dá)水平均顯著升高。
注意事項(xiàng)：現(xiàn)在仍不確定血液中神經(jīng)元外泌體的總量是否會(huì)隨著疾病狀態(tài)發(fā)生改變，因此，處理數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)在單個(gè)外泌體水平上進(jìn)行分析。此外，為了避免外泌體中蛋白質(zhì)降解，提取出外泌體后需要及時(shí)進(jìn)行分析。
前景展望：2013年Goetzl與人合作建立了NanoSomiX公司，希望能開(kāi)發(fā)出阿爾茨海默癥血液測(cè)試，以提前10-15年鑒定疾病風(fēng)險(xiǎn)，讓高風(fēng)險(xiǎn)人群使用預(yù)防性藥物。
外泌體microRNA診斷
研究者：Illinois大學(xué)副教授NeilSmalheiser
研究項(xiàng)目：自美人miRNA搖曳著身姿住進(jìn)了外泌體，使其蓬蓽生輝不少，也引得眾多研究者紛至沓來(lái)，只為求得與美人結(jié)一段緣。而這正是NeilSmalheiser所從事的研究工作，即從血漿外泌體中鑒定出AD患者的miRNA指標(biāo)
研究成果：Smalheiser研究團(tuán)隊(duì)使用了分離外泌體的傳統(tǒng)方法——差速離心（differentialultracentrifugation）逐漸洗掉游離RNA、蛋白聚合物和細(xì)胞殘骸，只留下外泌體。再?gòu)耐饷隗w中提取RNA及測(cè)序，并建立了成熟miRNA的數(shù)據(jù)集。隨后即可通過(guò)計(jì)算模型鑒定了一組可以將阿爾茨海默癥和對(duì)照準(zhǔn)確分開(kāi)的miRNA。
注意事項(xiàng)：超速離心難以實(shí)現(xiàn)高通量，也很難轉(zhuǎn)化到臨床中去。可利用ThermoFisherScientific公司的幾款總外泌體提取試劑盒（TotalExosomeIsolationReagent）分別從細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、血漿、尿液及其他體液中分離出完整的外泌體。另外，利用Trizol試劑提取RNA時(shí)，適量添加糖原可使RNA產(chǎn)量提升了將近23%，對(duì)提取低產(chǎn)量RNA是極其有利的。
細(xì)胞外RNA診斷
研究者：加州大學(xué)圣地亞哥分校副教授LouiseLaurent，美國(guó)轉(zhuǎn)化基因組研究所副教授KendallVanKeuren-Jensen
研究項(xiàng)目：Laurent和Keuren-Jensen作為美國(guó)NIH胞外RNA交流協(xié)會(huì)的成員，正在努力的推動(dòng)循環(huán)miRNA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化，提升細(xì)胞外RNA研究的可重復(fù)性。因而，他們希望鑒定出胎盤功能障礙（Laurent）和大腦損傷（Keuren-Jensen）的循環(huán)miRNA指標(biāo)。
研究成果：由于妊娠期間胎盤會(huì)將包含RNA的囊泡釋放到母體血液中，因而Laurent希望從中鑒定出胎盤疾病的miRNA指標(biāo)，比如子癇前期和宮內(nèi)生長(zhǎng)受限。其初步研究結(jié)果顯示，母體血液中的外泌體和微囊泡都可以分離出妊娠特異性miRNA。妊娠后期的miRNA指標(biāo)與胎盤組織的關(guān)系尤為密切。
而Keuren-Jensen研究團(tuán)隊(duì)則將監(jiān)控撞擊數(shù)據(jù)的感應(yīng)器裝在橄欖球運(yùn)動(dòng)員的頭盔中，并在橄欖球賽季中收集運(yùn)動(dòng)員的血液、尿液和唾液樣本。通過(guò)對(duì)這些樣本進(jìn)行RNA測(cè)序，尋找與撞擊數(shù)據(jù)有關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)。同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)不同的商業(yè)化試劑盒會(huì)對(duì)細(xì)胞外RNA的收集造成很大的差異。
注意事項(xiàng)：從血漿或血清中分離出疾病相關(guān)RNA（exRNA）之所以具有一定的挑戰(zhàn)性，一方面是因?yàn)閑xRNA豐度低，另一方面是因?yàn)檠褐械奈廴疚飼?huì)抑制PCR。因而，簡(jiǎn)化和加速exRNA提取過(guò)程的商品化試劑盒便成為了循環(huán)exRNA研究不可缺少的工具。
而VanKeuren-Jensen認(rèn)為利用“接頭”（短片段DNA的粘性末端，可靶向結(jié)合擴(kuò)增的目標(biāo)分子）的測(cè)序試劑盒可能給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)很大的變數(shù)。接頭的隨機(jī)化，可與某些miRNA結(jié)合得更好；但有些接頭二聚體比較少的試劑盒，其測(cè)序偏好比較大。因而，建議大家在論文中分享自己所用的試劑盒和分離方法，因?yàn)檫@些信息對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)很有幫助。
另外，Laurent則認(rèn)為減少樣本批次、盡量由同一個(gè)人操作有助于降低結(jié)果的差異性。另外，在沒(méi)有一個(gè)通用標(biāo)準(zhǔn)的情況下，設(shè)立內(nèi)參有助于去除產(chǎn)量或批次差異帶來(lái)的許多影響，可提高結(jié)果可重復(fù)性。
浙公網(wǎng)安備33010802007965號(hào)