2016年NgAgo技術(shù)的問世曾攪亂基因編輯的一湖池水，并掀起了驚濤駭浪而后續(xù)又飽受爭議。那么NgAgo技術(shù)到底如何，南通大學(xué)劉東教授于2016年11月發(fā)表于CellRes雜志的一篇文章《NgAgo-basedfabp11ageneknockdowncauseseyedevelopmentaldefectsinzebrafish》似乎將籠罩于NgAgo技術(shù)的濃霧吹散了一些。
前幾日劉教授在基因編輯學(xué)術(shù)研討會(huì)上也以基于NgAgo技術(shù)敲低斑馬魚基因表達(dá)為題，做了細(xì)致的研究報(bào)道。
南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉東教授
劉東教授在NgAgo技術(shù)發(fā)現(xiàn)之初，確實(shí)是想利用該技術(shù)進(jìn)行基因敲除。但是隨著實(shí)驗(yàn)的開展，他想要完成的基因敲除（knockout）并沒有實(shí)現(xiàn)，卻意外收獲了基因敲低（knockdown）這一結(jié)果。
基因敲除與敲低，雖然只有一字之差，但卻是兩個(gè)完全不同的學(xué)術(shù)概念。基因敲除是去掉不想要的基因，使目標(biāo)基因永久性地表達(dá)沉默；而基因敲低則保留目標(biāo)基因，只是阻斷目標(biāo)基因的表達(dá)，但在下一代生物體內(nèi)依然能夠進(jìn)行基因表達(dá)。敲除是基因編輯的功能之一，而敲低則不是。
為了探索靶基因Fabp11a（脂肪酸結(jié)合蛋白11a，在調(diào)解葡萄糖和脂代謝穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用）對斑馬魚胚胎發(fā)育中的生物功能，設(shè)計(jì)了針對該基因的兩條5'-磷酸化的ssDNA，并將其與優(yōu)化過的NgAgo-2nlsmRNA一起注射到1細(xì)胞期的胚胎中。
另外，為了確保注射的NgAgomRNA能進(jìn)入細(xì)胞核中表達(dá)NgAgo蛋白，研究者還專門在mRNA的兩端增加了核內(nèi)定位序列（NLS），而5’-磷酸化單鏈DNA專門靶向fabp11a的第二和第三個(gè)外顯子——如果NgAgo能編輯基因，這兩段基因序列會(huì)被改變。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射過的胚胎中約有30%會(huì)在發(fā)育后出現(xiàn)兩種眼部畸形的表型：眼部有一只相對小一點(diǎn)的眼睛而另一只顯得十分??；或者兩只眼睛融合形成一只較大的眼睛。
盡管該表型發(fā)生了變化，但是在抽提斑馬魚胚胎（正常/突變型）DNA并對靶基因進(jìn)行擴(kuò)增測序后，發(fā)現(xiàn)靶基因沒有任何基因突變，但通過RT-PCR檢測靶基因表達(dá)卻有顯著敲低。因而，劉東團(tuán)隊(duì)認(rèn)為NgAgo系統(tǒng)確能導(dǎo)致斑馬魚表型改變（眼部發(fā)育缺陷），但是與靶基因的編輯無關(guān)，反是通過靶基因的敲減（knockdown）來行使功能。
此外，為了確認(rèn)gDNA/NgAgo系統(tǒng)在斑馬魚中敲低基因是一種普遍的現(xiàn)象，也測試斑馬魚中的其他四個(gè)基因（ta、kdrl、lama1和flt1）。以基因ta（決定斑馬魚有無尾巴性狀）為例，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)約有30%注射過的胚胎出現(xiàn)沒有尾巴的表型，這也證明了NgAgo技術(shù)的knockdown作用是具有普遍性的。
無獨(dú)有偶，韓國科學(xué)家Jin-SooKim發(fā)表于論文預(yù)印本網(wǎng)站BioRxiv的文章《DNA-dependentRNAcleavagebytheNatronobacteriumgregoryiArgonaute》也認(rèn)為NgAgo系統(tǒng)切割的是RNA，而不是DNA。
韓國研究者發(fā)現(xiàn)NgAgo蛋白具有DNA依賴的RNA酶活性（依賴于二價(jià)金屬離子），且與NgAgo結(jié)合的DNA（gODNs）序列必須與RNA反向互補(bǔ)，而正義DNA（senseDNA）序列則不能引導(dǎo)NgAgo切割靶RNA。即當(dāng)與NgAgo結(jié)合的DNA序列如果與RNA序列相同，則不能引導(dǎo)NgAgo切割靶RNA。
他們還發(fā)現(xiàn)gODNs的長度和序列會(huì)對NgAgo切割RNA效率產(chǎn)生影響。當(dāng)gODNs長度低于13個(gè)核苷酸（nt）則完全不能介導(dǎo)NgAgo的RNA酶活性，而堿基錯(cuò)配會(huì)影響NgAgo的酶活性，尤其是第5-14nt（5’-3’方向）的堿基最為關(guān)鍵。因而，Kim的文章也從側(cè)面呼應(yīng)了在斑馬魚體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
而至于DNA序列對NgAgo系統(tǒng)的影響，劉東教授認(rèn)為Kim的研究結(jié)果只能解釋gODNs與RNA反向互補(bǔ)的情況。他指出即使NgAgo介導(dǎo)的DNA與mRNA的序列相同，也是存在基因下調(diào)活性的，只是活性比較低。但這與Kim等人的發(fā)現(xiàn)并不矛盾，他推測這可能是因?yàn)镈NA介導(dǎo)的NgAgo還會(huì)與靶基因結(jié)合，抑制了目標(biāo)DNA的轉(zhuǎn)錄造成的。
因而，相比于傳統(tǒng)方法，NgAgo技術(shù)其敲低效率是比較高的，可作為RNAi以外的另一種基因敲低（knockdown）工具來使用。而且即便如此，關(guān)于NgAgo技術(shù)仍有一些有趣的東西沒有研究清楚，需要進(jìn)一步的探索。
以上則是劉東教授關(guān)于NgAgo技術(shù)研究的后續(xù)研究工作，同樣他也希望能與其他研究團(tuán)隊(duì)合作一起挖掘并推動(dòng)對NgAgo和其它該家族蛋白的新的興趣點(diǎn)。
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