文章題目為Strategy for Global Profiling and Identification of 2-and 3-Hydroxy Fatty Acids in Plasma by UPLC-MS/MS ，是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所的再帕爾教授課題組近期發(fā)表在Analytical Chemistry上的一篇文章。
研究背景
脂肪酸是體內(nèi)一類重要的脂類成分，參與機(jī)體眾多代謝過程，包括細(xì)胞凋亡，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胰島素抵抗以及能量代謝等。除了大多數(shù)的直鏈脂肪酸外，還有一些脂肪酸的衍生物（包括支鏈脂肪酸、羥基脂肪酸等）在生物體的代謝過程中也發(fā)揮著重要作用。本研究中，作者的關(guān)注點(diǎn)就集中在羥基脂肪酸上，這類化合物與脂肪酸的氧化有密切聯(lián)系。
羥基脂肪酸（OHFA）的分類：最常見的形式為2-羥基脂肪酸（2-OHFAs）和3-羥基脂肪酸（3-OHFAs）兩類。盡管這類化合物在機(jī)體中發(fā)揮重要作用，但是由于其在體內(nèi)濃度較低，在分析時(shí)通常會(huì)被忽略。
檢測(cè)方法：
基于質(zhì)譜的鳥槍法：通過對(duì)C=C雙鍵或者羧基進(jìn)行衍生，達(dá)到區(qū)分異構(gòu)體的目的，但是脂質(zhì)提取物直接注入帶來的離子抑制作用影響了低濃度脂肪酸的檢測(cè)。
氣質(zhì)聯(lián)用：通常需要對(duì)樣本進(jìn)行甲酯化，但是衍生化的操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還會(huì)引入multi-origination和multipeak 現(xiàn)象，進(jìn)而影響定量分析的準(zhǔn)確性。
液質(zhì)聯(lián)用：擁有高靈敏度和高選擇性，已建立了一些方法用于羥基脂肪酸的檢測(cè)，但是由于標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏，這些方法只關(guān)注了一小部分2-OHFAs或3-OHFAs。
目前還沒有一個(gè)方法能夠同時(shí)對(duì)2-OHFAs和3-OHFAs進(jìn)行檢測(cè)，本研究就將使用LC-MS/MS技術(shù)建立方法，同時(shí)對(duì)生物樣本中的2-OHFAs和3-OHFAs進(jìn)行全面檢測(cè)分析。
實(shí)驗(yàn)流程：
分析2-OHFAs和3-OHFAs的串聯(lián)質(zhì)譜圖，尋找特征離子，建立包含母離子信息和子離子信息的理論數(shù)據(jù)庫；
使用LC-Orbitrap MS分析血漿樣本，用上述數(shù)據(jù)庫對(duì)樣本中的2-OHFAs和3-OHFAs化合物進(jìn)行歸屬（通過對(duì)比其他脂肪酸類異構(gòu)體的特征碎片離子，可以避免歸屬信息錯(cuò)誤）；
根據(jù)碳鏈長度，C = C雙鍵數(shù)和羥基位置，構(gòu)建與結(jié)構(gòu)有關(guān)的保留行為預(yù)測(cè)模型，從而進(jìn)一步證實(shí)OHFA的結(jié)構(gòu)；
采用留一法進(jìn)行交叉驗(yàn)證法對(duì)模型預(yù)測(cè)的穩(wěn)健性和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估；
方法建立完成，用于食管鱗狀細(xì)胞癌患者（ESCC）血漿樣本檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物 。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
樣本提取方法：
對(duì)多種溶劑系統(tǒng)提取效果進(jìn)行比對(duì)，最后選擇使用的提取方法為1μL血漿+300μL甲醇+800μL MTBE
2-OHFAs和3-OHFAs類物質(zhì)的色譜分離
使用20種標(biāo)準(zhǔn)品來優(yōu)化LC-MS/MS方法，如圖所示，標(biāo)準(zhǔn)品得到很好分離。從圖中可以發(fā)現(xiàn)在反相色譜中1. 3-OHFAs的出峰時(shí)間比起對(duì)應(yīng)的2-OHFAs異構(gòu)體出峰時(shí)間早；2. 兩類物質(zhì)的保留時(shí)間隨著碳鏈長度的增加而增加，隨著雙鍵數(shù)的減少而增加。
總結(jié)碎片離子規(guī)律，建立數(shù)據(jù)庫
碎片規(guī)律：
2-OHFAs產(chǎn)生46.0049Da中性丟失；3-OHFAs通過麥?zhǔn)现嘏女a(chǎn)生碎片離子m/z 59.0138
基于上述規(guī)律，可以從理論上計(jì)算2-OHFAs和3-OHFAs類物質(zhì)的碎片離子，通過計(jì)算，最終建立了一個(gè)in-house數(shù)據(jù)庫，包含碳原子數(shù)（4-26），C=C雙鍵數(shù)（不飽和度0-6），以及對(duì)應(yīng)物質(zhì)的母離子和子離子信息。
在血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如果一個(gè)峰的質(zhì)荷比與數(shù)據(jù)庫中記錄的數(shù)值偏差小于10ppm，那么這個(gè)峰將被添加至inclusion list中在PRM模式下獲取串聯(lián)質(zhì)譜信息。
如果串聯(lián)質(zhì)譜信息與數(shù)據(jù)庫中記錄的特征離子相匹配，那么該物質(zhì)將被作為2-OHFAs和3-OHFAs候選離子。上圖顯示的就是血漿樣本中不飽和度為0和1的2-OHFAs和3-OHFAs物質(zhì)，藍(lán)色表示已經(jīng)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，紅色表示在HMDB數(shù)據(jù)庫中還沒有記載的新發(fā)現(xiàn)的羥基脂肪酸。
避免錯(cuò)誤歸屬：
46.0049Da中性丟失和碎片離子m/z 59.0138并不是2-OHFAs和3-OHFAs的專屬特征信號(hào)，很多n-OHFAs或者環(huán)氧脂肪酸也具有這些特征。通過文獻(xiàn)檢索，可對(duì)羥基脂肪酸的碎片離子做如下總結(jié)：
對(duì)于羥基脂肪酸類物質(zhì)來說， 碎片離子m/z 59.0138是3-OHFAs的特有離子，但是其對(duì)應(yīng)的環(huán)氧或者環(huán)酮類異構(gòu)體也可以產(chǎn)生此碎片。由于這類環(huán)氧或環(huán)酮官能團(tuán)通常出現(xiàn)在脂肪鏈的中間位置，所以他們出來有m/z 59.0138碎片離子外，還有其他豐富的碎片離子。
2-OHFAs和ω-OHFAs（末端羥基脂肪酸）都可以產(chǎn)生46.0049 Da中性丟失作為主要碎片離子；其他羥基脂肪酸也可以產(chǎn)生該中性丟失，但是通常會(huì)同時(shí)產(chǎn)生其他的碎片離子。因此，2-OHFAs和ω-OHFAs可以通過碎片離子與其他羥基脂肪酸類物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。
羥基位置的不同，會(huì)導(dǎo)致色譜行為的差異，有報(bào)道顯示在反相色譜中ω-OHFAs比其對(duì)應(yīng)的 2-OHFAs異構(gòu)體出峰時(shí)間早，可以幫助我們區(qū)分 2-OHFAs和ω-OHFAs。
所以，要想?yún)^(qū)分羥基脂肪酸類物質(zhì)，需要綜合考慮保留時(shí)間和碎片信息。
構(gòu)建與結(jié)構(gòu)相關(guān)的保留時(shí)間預(yù)測(cè)模型
要想確定2-OHFAs和3-OHFAs的結(jié)構(gòu)，僅依靠一級(jí)質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜信息是不夠的，而且之前總結(jié)的碎片離子并不是此類物質(zhì)所特有，所以保留時(shí)間也是需要考慮的信息。OHFA的保留行為與其化學(xué)結(jié)構(gòu)（包括羥基位置、碳鏈長度、C=C雙鍵數(shù)）有密切聯(lián)系。對(duì)于具有相同不飽和度的2-OHFAs和3-OHFAs來說，其保留時(shí)間隨著碳原子數(shù)的增加呈線性增加。
以3-OHFAs為例，此類物質(zhì)的保留時(shí)間與碳原子數(shù)呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9933，使用該相關(guān)方程對(duì)六個(gè)物質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其結(jié)果與化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)證實(shí)準(zhǔn)確。
考察了保留時(shí)間與不飽和度之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示C=C雙鍵數(shù)與保留時(shí)間呈線性負(fù)相關(guān)。
建立3D-模型用于不飽和3-OHFAs鑒定，3D圖中直觀地顯示了保留時(shí)間與其碳鏈結(jié)構(gòu)的關(guān)系。
最終使用上述模型，在血漿中檢測(cè)到了32個(gè)3-OHFAs，其中20個(gè)為最新報(bào)道的物質(zhì)。
同樣的，2-OHFAs也建立了相同的預(yù)測(cè)模型。需要注意的是，大多數(shù)的2-OHFAs候選物質(zhì)都是飽和的，只有少數(shù)幾個(gè)物質(zhì)含有C=C雙鍵，而且只有1個(gè)不飽和的2-OHFAs標(biāo)準(zhǔn)品，所以沒有辦法構(gòu)建2-OHFAs不飽和度與保留時(shí)間的預(yù)測(cè)模型。但是，2-OHFAs的保留時(shí)間與其對(duì)應(yīng)的3-OHFAs異構(gòu)體的保留時(shí)間呈現(xiàn)很好的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999（圖5B），所以我們可以通過對(duì)應(yīng)的3-OHFAs的保留時(shí)間推測(cè)2-OHFAs的保留時(shí)間，作者使用FA（18:1）-2OH標(biāo)準(zhǔn)品來驗(yàn)證預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。
最終使用上述模型方法，作者鑒定了18個(gè)2-OHFAs，其中7個(gè)為新報(bào)道物質(zhì)。
方法應(yīng)用：
檢測(cè)ESCC患者和健康人血漿樣本中的2-OHFAs和3-OHFAs信息，尋找生物標(biāo)記物，用于探究該類羥基脂肪酸在疾病過程中的變化。最后發(fā)現(xiàn)6個(gè)羥基脂肪酸類物質(zhì)在ESCC患者中發(fā)生明顯改變，標(biāo)明其與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
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